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    公开号:WO1988009374A1
    申请号:PCT/EP1988/000452
    申请日:1988-05-20
    公开日:1988-12-01
    发明作者:Reinhard TÖPFER；Josef S. Schell；Hans-Henning Steinbiss
    申请人:Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissensc；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    Embryonen von Nutzpflanzen als Aufnahmesystem fürfremde genetische In formationDie Erfindung betrifft freigelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen als Aufnahmesystem fur fremde genetische Information in Form von DNA oder RNA. Ferner betrifft die Erfindung offengelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen mit einem Gehalt an eingeschleuster fremder genetischer Information,Verfahren zur Herstellung der genannten Embryonen und ihreVerwendung zur Regenerierung und Zuchtungvon transgenenNutzpflanzen. Agrobacterium tumefaciens als gut untersuchtes und einfach zu handhabendes Gentransfersystem, in der Hauptsache für dicotyle pflanzen, ist bisher auf nur wenige monocotyle Pflanzen angepapt worden. Ein direkter Gentrans-fer auf Pflanzen, d.h. ein Gentransfer ohne bakterielle oder virale Vektoren ist daher eine alternative Transformationsmethode und konnte fürPflanzen, die schlechte Wirte fürAgrobacterium darstellen, zu grösserer Bedeutung gelangen. Gerade zu diesen Pflanzen zahlenviele wirtschaftlich bedeutsame und gentechnologisch bisher kaum handhabbare Nutzpflanzen, insbesondere dieGetreidepflanzen und Leguminosen. Etabliert ist der Einsatz von Protoplastenals Objekt fur den direkten Gentransfer. Dies gilt auch fur Protoplastenvon Getreidepflanzen. Bisher ist es aber nur in Ausnahmefallen gelungen, Getreideprotoplasten zu reifen Pflanzen zu regenerleren. Deshalb mupweiter nach alternativen Wegen gesucht werden. Mit der Arbeit von De la Pena et al., Nature 325 (1987) 274-276, ist ein neuer Weg des direkten Gentransfers auf eine Nutzpflanze erstmals erfolgreicheingeschlagen worden. Plasmid-DNA wurde in junge Roggenährenetwa 2 Wochen vor der Meiose injiziert. In der F1-Generation wurden transformiertePflanzen selektiert. Auperdieser Methode wurden auch Methoden beschriebenrdenen die Inkubation verschiedener Explan-tate mit nackter DNA gemeinsam ist. Die Behandlung von Pollen, Samen, Keimlingen oder multizellulären Strukturen höherer Pflanzen mit fremder DNA ist bereits bekannt, wird aber wegen des Fehlens eingehender Beweise kontroversdiskutiert. Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neuesSystem zum Einschleusen fremder genetischer Information inNutzpflanzen, insbesondere in Getreidepflanzen und in Leguminosen, bereitzustellen. Die Ldsungdieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in en P a t e n t a n s p r ü c h e n gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Gegenstand der Erfindung sind somit freigelegte reife Em bryanenvon Nutzpflanzen als Aufnahmesystem fur fremde genetische Information in Form von DNA adderRNA. Embryonen reifer Samen sind in der Lage wahrend der Quellung, im isaliertenZustand oder im Samen (beispielsweise mechanisch freigelegt), fremde genetische Information aufzu nehmen.Diese "fremde genetische Information" kann sowohl DNA als auch RNA sein, die sich selbst repliziert und infek tiasist oder stabil in das Genom integriert ist. In gleicher Weise werden Viraide adderViren vom Begriff "fremde genetische Information erfasst.Als "fremde genetische Infor mationwird auch eine genetische Information bezeichnet, die naturlichin der Nutzpflanze vorkommt, jedoch zur Erzielung phänotypischerVeranderungen zusatzlich in weiteren Kopien in die Nutzpflanze eingebracht wird, beispielsweise können auf diesem Weg naturlich in der Nutzpflanze vorkommende Gene amplifiziert werden. Neben Embryonen reifer Samen ist es aber auch möglich,in einen samenruheahnlichenZustand überführte, somatischeEmbryonen oder künstlicheSamen (artificial seeds) einzusetzen. Gegenstand der Erfindung sind ferner offengelegte reife Em bryanenvon Nutzpflanzen mit einem Gehalt an eingeschleuster fremder genetischer Information in Form von DNA oder RNA. Die Begriffe "offengelegt", "freigelegt" und "isoliert" sind hier folgendermapen definiert:Als offengelegte Embryonen werden erfindungsgemäss Embryonen bezeichnet, deren Samenschale zumindest teilweise entfernt ist, so dapder Embryo fur eine fremde genetische Information in Form von DNA oder RNA zuganglichwird. Der Begriff offengelegte Embyonenist somit als Oberbegriff zu verstehen. Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen offengelegten Embryonen mit einem Gehalt an fremder genetischer Information sind isolierte Embryonen und freigelegte Em bryanen. Mit dem Begriff "isolierteEmbryonen" werden Embryonen bezeichnet, die vom Speichergewebe des Samens abgetrennt sind. Ein Verfahren zur Herstellung isolierter Weizenembryonen ist aus Johnston & Stern, Nature 179 (1957), Seiten 160 bis 161, bekannt. Johnston & Stern beschreiben jedoch nicht die Verwendung solcher Embryonen zur Regenerierung und Zuchtungtransgener Nutzpflanzen. Mit dem Begriff "freigelegte Embryonen" werden Embryonen bezeichnet, die sich noch im strukturellen Verband des Samens befinden und bei denen die Samenschale derart geöffnetist, dapdie fremde genetische Information in den Embryo gelangen kann. Die freigelegten Embryonen werden erfindungsgemäss besonders bevorzugt, da sich ausgehend von freigelegten Em bryanenbei der Regenerierung und Zuchtungtransgener Nutz pflanzen eine noch hohere Ausbeute an regenerierten Pflanzen erzielen lässt,als mit isolierten Embryonen. Der Zusammenhang der Begriffe "offengelegte", "freigelegtè''und "isolierte" Embryonen kann also folgendermassen verdeutlicht werden: Offengelegte Embryonen (Samenschale ist ganz oder teilweise entfernt)EMI4.1 Isolierte Embryonen Freigelegte Embryonen (Samenschale und Speichergewebe (Samenschale ist nur sin vollständig enternt; vgl. geöffnet bzw. teilJohnston und Stern) weise entfernt; erst mals in dieser Erfin dung beschrieben) Erfindungsgemässkann die fremde genetische Information entweder frei in den Zellen vorliegen,oder in das Genom derZellen integriert sein. Eine in den Zellen der Embryonen frei vorliegende genetische Information könnte man auch als "gentechnologischen Pflanzenschutz" bezeichnen. Offengelegte Embryonen konnenals Pfortefur genetische Information dienen, die sich selbst vermehrt und in derPflanze ausbreiten kann, mit dem Ziel, auf die ganze aus demEmbryo entstehende Pflanze überzugreifenbzw. diese zu infizieren. Embryonen kannen ftireinen begrenzten Zeitraum das Genprodukt fremder genetischer Information herstellen, welches mit den heute ublichen Messmethoden zu erfassen ist. Damit besteht eine Alternative zur Messung der transienten Expression chinmarer Gene in den aufwendiger zu handhabenden Protoplasten. Es ist eine gewebespezifische Expression zu erwarten, da es sich um ein vollständiges Gewebe handelt. Die Spezifitatder Expression laptsich ferner durch Verwendung bestimmter Promotoren steuern. Die erfindungsgemässen offengelegten reifen Embryonen vonNutzpflanzen werden vorzugsweisedurch mechanische Behandlung des Samens erhalten. Durch das Entfernen z.B. durch Abschleifen der Samenschale im Bereich des Embryos, kann derEmbryo freigelegt werden. Dabei erfolgt das Abschleifen derSamenschale derart, dap der Embryo fur eine fremde genetische Information in Form von DNA oder RNA zugänglichwird, jedoch in seiner Keimfähigkeitnicht wesentlich beeinträch-tigt wird. Das erfindungsgemässeAbschleifen der Samenschale ist schonendfur den Embryo und rasch durchführbar.Daher wird es erfindungsgemäss ermöglicht,in kurzer Zeit zahlreiche Nutzpflanzen ausgehend von behandelten Embryonen zu züchten,die einen Gehalt an fremder genetischer Information aufweisen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von offengelegten reifen Embryonen von Nutzpflanzen mit einem Gehalt an eingeschleuster fremder genetischer Information in Form von DNA oder RNA, bei den man offengelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen mit einer waprigenLösung der genetischen Information in Form von DNA oder RNA behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässenVerfahrens beträgtder Wassergehalt der Embryonen hachstensetwa 20 Gew.-%. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsformdes erfindungsgemässen Verfahrens hat die wässrige Lösung einen pH-Wert von 3 bis etwa 11. Die erfindungsgemässen offengelegten reifen Embryonen vonNutzpflanzen sind hervorragendzur Regenerierung und Zuch-tung transgener Nutzpflanzen geeignet. Insbesonderesind sie zur Regenerierung von Getreidepflanzenund Leguminosen gesignet. Die Regenerierung und Züchtung der transgenen Nutzpflanzen ausgehend von den erfindungsgemässen Embryonen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Bei der Erarbeitung der erfindungsgemässen Lasungwurden zunächstExperimente zur transienten Expression durchgeführt. Der Leitgedanke war dabei zunachsteine Expression bestimmter chimärer Gene fur einige Tage (also transient) zu -erreichen. Chimäre Gene sind in vitro zusammengefügte DNABaustein, die ein funktionsfähiges kunstlichesGen bilden und z.B. auf einem Plasmid lokalisiert sind. Die folgendeTabelle I zeigt darauf aufbauend die erfindungsgemässe Strategie am Beispiel des Weizens. Tabelle IEMI6.1 <tb> TLansienie <SEP> Expression <SEP> chim rer <SEP> Ger.e <SEP> in <SEP> isoherten <SEP> Weizertembrvonen<tb> <SEP> t<tb> <SEP> Re roduziercar'-eic<tb> <SEP> HerÅaanls.Ttus <SEP> re- <SEP> * <SEP> z <SEP> Qpcimierung <SEP> der<tb> <SEP> D <SEP> nufn2:nse <SEP> Di9.-- <SEP> xpression<tb> <SEP> y<tb> <SEP> T <SEP> ransLormaLIon<tb> Nachfolgen werden experimentelle Ergebnisse beschrieben, angefangen von der Beobachtungeiner gelegentlichen Expression eines chimären Gens, uber die Suche nach reproduzierba-ren Bedingungen, dem Versuch einer Klarung des Mechanismus der DNA-Aufnahme, verknupftmit dem Streben nach einer Optimierung der Expression, bis hin zu Experimenten, aufbauend auf den gewonnenen Erkenntnissen, die zu transient oder stabil transformierten Pflanzen führen knnen.Das bedeutet, dass aus den behandelten Embryonen auch Pflanzen regeneriert werden knnen,die selbst oder deren Nachkommen transformiert sind, also fremde genetische Information enthalten, die gegebenenfalls in ihrem Genom integriert ist. Die Regeneration der behandelten Embryonen erfolgt nach üblichenVerfahren, nämlich beispielsweise durch Kultur auf gew6hnlichen Nährböden nach Kallusinduktion, induktionsomatischerEmbryogenese oder unter Ausnutzung der naturlichenNähr- stoffreserven des Samens. Die in Tabelle I oben verwendeten Begriffe werden nachfolgend erläutert. ReproduzierbarkeitIn den ersten Experimenten mit Weizenembryonen lagen die Hauptschwierigkeitenin der Reproduzierbarkeit, Zunachstwaren mit 15 mg isolierten Embryonen gelegentlich NPT IISignale beobachtetwarden. Erst die Erhöchung der Embryomengeauf 300 mg ergab reproduzierbare, wenn auch in der Intensi ttunterschiedliche NPT IISignale (Fig. la). Diese Schwankungen können als experimentelle Abweichungen angesehen werden, aber auch als eine verschieden starke DNA-Aufnahme undDNA-Expression einzelner Embryonen. Abgesehen von der Tatsache, dapdie NPT IISignale in drei identisch angelegten, aber unabhängig voneinanderdurchgeführten Experimenten gefunden wurden, müssen diese Daten dachkritisch betrachtet werden. EndogeneSignale kdnnenausgeschlossen werden, da in keinem Fall NPT II AktivitatinExtrakten von Embryonen ohne DNA-Behandlung gefunden wurden. Kontaminationen in Form von Bakterien oder Pilzen als Ursache fur die beobachtetenNPT IISignale knnenweitgehend ausgeschlossen werden. Gegen Bakterien wurde Claforan# dem Medium zugesetzt und Pilze waren während der Kultur nicht sichtbar. Traten dennoch Pilzkontaminationen im LaufederKultur auf, so wurden diese Teile verworfen.WeiterführendeVersuche mit Fungiziden oder Sterilisierung der Embryonen, um Langzeitkulturen anzulegen, schlugen fehl.Statt dessen wurde auf eine Kultur von angeschliffenen Samen ausgewichen. Weiterhin zeigten Kontrollexperimente mit Endospermstucken(berechnet auf gleiches Frischgewicht nach der Kultur) keineNPT II Aktiität. Mechanismus der DNA-AufnahmeNachdem die Reproduzierbarkeit erwiesen war, stelltensich die in enger Wechselwirkung stehenden Fragen nach dem Mechanismus der DNA-Aufnahme und der Optimierung der NPT IIEx Expression.Zwei Barrieren mup die DNA uberwinden,um zunachsteinmal das Cytoplasmazu erreichen: Zellwandund Plasmalemma. Die Wanderung von DNA-Molekülen durch Zellwände scheint unmöglich, es sei denn, der trockene Embryo weist gewisse Besonderheiten auf. Carpita et al., Science 205 (1979), 1144 1147, bestimmtendie Prengrösse in Zellwänden von Acer pseudoplatanus Suspensionskulturzellen mit 3,8 bis 4 nm. Das entspricht einer freien Permeabilitatfur Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1300 bis 1600 und im Vergleich dazu fur ein globuläres Protein bis zu 17000 d bei entsprechendem Molekulradius.Das aber durfte viel zu klein sein fur das Durchschlüpfen eines Plasmids von 4,15 kb (2,7 x 106d).Wieso kann aber dennoch transiente Expression inEmbryonen beobachtetwerden Der Vergleich von Suspensionskulturzellen mit den "plasmareichen und zartwandigenZellen" eines Embryos ist nur mit Einschrankungen erlaubt. So befinden sich Suspensionskulturzellen nicht in einem geordneten Zellverband und ihr Zellwandaufbau dürfte von dem der Embryonen verschieden sein Zudem können die Quellungsvorgange die Penetrierfähigkeit von Makromolekulenbeein flussen, was letztlich zu den oben angedeuteten Besonderheiten des trockenen Embryos zu zahlenist. Ein anderer Weg der DNA durch die Zellwand könnte über Verletzungen des Embryos als Folgeder Isolierung(Fig. lb) oder des Anschleifens führen. Das bedeutet, dapnur an verletzte Stellen gr.enzende Zellen fremde DNA aufnehmen knnenund fur die Expression verantwortlich sind, es sei denn, es erfolgt eine Wanderung der DNA-Molekulevon Zelle zu Zelle durch Plasmodesmen. Die zarten Zellwände embryonalerZellen während der Quellung oder die Verletzungen sind magliche Ursachen die bestehendeBarriere Zellwandzu passieren. Das Plasmalemma ist damit aber noch nicht überwunden. Es ist allgemeinbekannt, daP DNA die Zellmembran nicht passieren kann. Chemische Agenzien, Elektropulse oder beides zusammen werden erfolgreicheingesetzt, um die Kontrollfunktiondes Plasmalemma zu umgehen und transiente Expression in Protoplasten zu erreichen. Erfindungsgemäss (Fig. la und 2) wurde gezeigt, dass auch ohne solche Hilfsmittel eine transiente Expression vorhandenist, aber beispielsweise mit DMSO verstärkt werden kann. Der trockene Embryo scheint daher über besondere Eigentümlichkeiten zu verfügen.Dap das frühe Stadium der Quellung kritisch ist, belegen sowohl Studien der Ultrastruktur, als auch Beobachtungen zur Permeabilität. Eine DNA-Aufnahme, gemessen als NPT IIExpression, erfolgt am besten in trockene Embryonen mit einem Wassergehalt von h5chstensetwa 20 Gewichtsprozent. Je weiter die Quellung fortgeschritten ist, desto geringer fällt die Expression aus (Fig. 2). Dies steht in Einklang mit der maglichenRekonstitution der Zellmembran. Ebensoentspricht der EinflupvonDMSO dieser Vrstellung, indem es die Membranrekonstitution oder allgemein die Membranpermeabilität beeinflussen kannte(Fig. 3).Optimierung der NPT II-ExpressionNach den Untersuchungen zum Mechanismus der DNA-Aufnahme, galt das Hauptinteresse der ODtimierunader NPT II Ex Expression,um mit den erreichten Verbesserungen Versuche zur stabilen transformation unternehmen zu knnen. Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dapDMSO, bei Weizenembryonen im Optimum 20 %, einen fördernden Einfluss (Fig. 3,Mitte) auf die NPT II Expression hat. Zwei weitere Experimente führten zu verbesserten Bedingungen für transiente Expression. Anstatt 300 mg trockener Embryonen pro Versuch (Fig. la und 2) einzusetzen, konntennach der Verwendung von DMSO zumindest gleiche Ergebnisse mit 150 mg Embryomaterial erzielt werden (Fig. 3 oben). Die Reproduzierbarkeit wurde sogarbis 30 mg Embryonen nachgewiesen, allerdings mit viel schwächeren Signalen. Eine Verbesserung brachte der Einsatz von 100 g Plasmid DNA (Fig. 3, unten). Die Figuren zeigen:Figur 1: (a) Ergebnis eines NPT II-Tests: C = Kontrolle,mit pRTlOOneostabil transformierter Tabak-Kallus; Spur I= transient pRTlOOneoexprimierende Tabakprota-plasten; Spuren 2 bis 5 = keimende Weizenembryonen, Material von 300 mg gequollenentrockenen Embryo nen, ohne DNA-Behandlung (Spur 2) und mit je 50 g pRT100neo in 15 mM NaCL und 1,5 mM Trinatriumcitrat inkubiert (Spuren 3 bis 5); * = unspezifische pflanzliche Aktivit t;Km = Kanamycinphosphat (Reaktionsprodukt der Neomycinphosphotransferase "NPTII"). (b) Isolierte, trockene Weizenembryonen der 0,71 mm Fraktion.Dieses Material wurde zur transienten Expression eingesetzt und besteht aus mehr oder weniger vollständigen Embryonen, Embryostückenund wenigen Endospermstücken. Die Pfeile weisen auf Verletzungen an den Embryonen hin. (c) Abbau der Plasmid-DNA nach verschiedenen Inkubationszeiten (in Stunden) mit Weizenembryonen (links) und Stabilität der DNA bei Abwesenheit von Embryonen (rechts). Figur 2: Ergebnis eines NPT II-Tests, durchgefuhrtmit kei menden Weizenembryonen (Doppelproben). Spuren 1 und 2 = Embryanen,die zunachst30 Minuten mit DNA-Lö- sung (100 g Plasmid DNA pro Milliliter, 15 mM NaCl,.1,5 mM Trinatriumcitrat), dann 30 Minuten mit 15 mM NaCl und 1,5 mM Trinatriumcitrat (ohne DNA) behandelt warden waren; Spuren 3 und 4 = Embryonen, die in umgekehrter Reihenfolgeinkubiert wurden, zuerst mit Lo..sungohne DNA, dann mit DNA-Lösung. C = positive Kontrolle; * = unspezifische pflanzliche Aktivität; Km = Kanamycinphosphat. Figur 3: Ergebnisse von NPT II-Tests, durchgefuhrtmit kei menden Weizenembryonen: (oben) NPT II-Signale als Funktionder Embryomenge, unter Verwendung von 20 % DMSO und 50 4gDNA wäh- rend der Inkubation; (Mitte) 150 mg Embryonen be handelt mit 50 g DNA unter Zugabe von verschie denen DMSO Konzentrationen; (unten) NPT II-Expres sion in Abhängigkeitvon der Plasmid Konzentration unter Einsatz von 150 mg Embryonen und 20 %DMSO. C = positive Kontrolle;nur NPT II-Signale sind ge zeigt. -Figur 4: (a): Konstruktionsweg der Kassette pRT100.Neben den Pfeilen sind die zur Clonierungverwendeten, in den einzelnen Schemata nur die wichtigsten Restrik tionsschnittstellen angegeben. Auffüllreaktionen von 5'- und Entfernen van 3'-überhängenden Enden erfolgten mit Klenow-Palymerase.Die intergenischeRegion des CaMV Isolates Cabb B-D wurde als EcoRI Subclon in fd 11-6 von Volker Matzeit (1982;Di plomarbeit an der Universität zu Köln)erhalten. Ausgehend von diesem Clon wurde das Poly-A Signal (schraffiert) als HphI-RsaI-Fragment in die HincII Schnittstelle von pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) ligiert, der Promotor (punktiert) wurde als HphI-HincII Fragment in die HincII-Schnittstelle von pUC19 cloniert. An schliessend wurde er unter Umkehr der Orientierung mit seiner abgeschnittenen PstI-Schnittstelle in die aufgefullte Xhoi-Schnittstelleeines pUCl9-De rivats, dessen SmaI- und KpnI-Schnittstellen durch XhoI- und NcoI-Schnittstellen ersetzt sind, umclo-niert. Nach dem Deletieren der XbaI-Schnittstelle wurdenPromotor und Poly-A Signal abschliepend tiberScaI und SstI zu pRT100 kombiniert. (b) DNA Sequenz der Xassettein pRT100. Die Poly linkersequenzen sind durch Kleinbuchstaben gekenn zeichnet, die CaMV-Sequenzen durch Gropbuchstaben. Markiert sind die TATA Box (unterstrichen), der vermutliche Transkriptionsstart (#).das ATG in der NcoI Schnittstelle, der Polyadenylierungsbefehl (unterstrichen) und das vermutliche Transkriptions ende (@). Figur 5: Schematische Übersicht der Konstruktion pRTl00nea. Aus pUC18kan&num;4 wurde das NPT II-Gen als SalI-Frag ment herausgeschnitten und in pUR250 (Rüther, Nucl. Acids Res. 10 (1982), 5765-5772) subclaniert.Ein etwa 180 bp gropes PstI-Fragment mit dem 5'-Ende des NPT II-Gens wurde dann aus diesem Intermediat entfernt und in ein pUC18-Derivatohne HindIII- Schnittstelle cloniert.In diesen Clon konnte nach HindIII-Spaltung, Auffüllreaktion und Ligation mit einem 8 bp gropen Linker eine NcoI-Schnittstelle und damit ein ATG-Codon eingefugtwerden. Aus letzterem Clon wurde abschliepend das 5'-Ende des NPT II-Gens als NcoI-PstI-Fragment herausgeschnit ten und zusammen mit dem 3'-Ende des NPT II-Gens als PstI-XbaI-Fragment in pRT100,geschnitten mit NcoI und XbaI, cloniert. Material und Methoden:Molekularbiologische Analysen wurden gempManiatis et al. (1982 ) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, durchgeführt.ChimeGene Erfindungsgemäwurde als Modell das Plasmid pRT100neo mit dem vom Cauliflower MosaikVirus (CaMV) 35S Promotor gesteuerten Neomycinphosphotransferase II-Gen (NPT II) als chimärem Marker-Gen verwendet. Die Konstruktion ist in denFiguren 4 und 5 detailliert beschrieben. Figur 4a veranschaulicht die Konstruktiondes Expressionsvektors pRT100, der den 35SPromotor aus CaMV (Isolat Cabb B-D) und das zu gehörigeCaMV-Polyadenylierungssignal trägt. Figur 4b zeigt die Clonierungsschritte, die zu pRT100neo gefuhrt haben. Es konnte gezeigt werden, dapdie fur transiente Studien eingesetzten Plasmide (fremde genetische Information) unabhangigvon ihrer Konformation sowohlin den verschiedenen circula-ren Formen als auch in linearer Form verwendet werden kön- nen. Fremde genetische Information bedeutet DNA oder RNA, die selbstreplizierend und infektiösist oder die stabil insGenom integriert ist. Andere Plasmide, die bezûglich der vorgegebenenFragestellung zu gleichen Resultaten fuhren,sind z.B. pCAP212 (Velten und Schell, ; Nucl. Acids Res. 13 (1985), 6981-6997) oder Derivate von pDH51, wie pEP9 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 5857-5868). Gewebekultur und TransformationsmethodenDie Versuche wurden in der Regel mit ungebeiztem Sommerweizen-Samen durchgeführt. Es kann aber auch Samen anderer Getreide verwendet werden wie Winterweizen, Sommergerste, Wintergerster Sommerroggen, Winterroggen, Triticale, Hafer,Mais, Reis und Sorghum oder anderer Nutzpflanzen, wie Erbse,Bohne, Sojabohne, PsophocarpusDer Begriff "reifer Samen" oder kurz "Samen" beschreibt ein der Verbreitung und der Arterhaltung dienendes Organ der ha-heren Pflanze, das aus dem Keimling (Embryo), dem Nährgewebe (Endosperm) und einer mehr oder weniger festen Samenschale (Testa) besteht. Die Isolierunavon Embrvonendurch mechanische Einwirkuna erfolgt gemäss der Vorschriftvon Johnston und Stern (Nature 179 (1957), 160 - 161) mit Ausnahme der Verwendung vonTrockeneis: 650 g Weizensamen in 130 g Portionedwurden 10Sekunden in einem 1 1 Behalterbei geringster Geschwindigkeit mittels Waring Blendoir# zerkleinert.Die zerschlagenen Cornerwurden mit Prufsieben(1,6 mm; 1,0 mm; 0,5mm Maschenweite) fraktioniert. Die 1,6 mm Fraktionwurde dreimal in gleicher Weise behandelt. Kleie- adderSpelzenanteile wurden mit hilfe eines Gebläses entfernt und die Embryonen vom Endospermdurch Flatierenmit Cyclohexan/Tetrachlorkohlenstoff getrennt. Tabelle I gibt die empirisch bestimmten Mischungsverhaltnissevon Cyclohexanmit Tetrachlorkohlenstaffzur Embryo-Endaspermtrennungfur die einzelnen Getreide wieder. Abschliepend wurden mehr oder weniger vollständige Embryonen mittels Sieb (0,71 mm Maschenweite) von Embryobruchstückenabgetrennt. Diese 0,71 mm Fraktion ist in Figur lb wiedergegeben. Die Ausbeute an Embryonen entspricht fur Sommerweizen etwa 40 %. Tabelle II Cyclohexan/Tetrachlorkohlenstoff Mischungsverhäitnisse zur Trennung von Embryonen und Endosperm verschiedener Getreide Getreide AnceileAnteile Tecra- Bemerkungen Cyclohexan chlorkohlenstoffSo-Weizen 100 250 W1-Weizen 100 250 So-Gerste 100 250 Wi-Gerste 100 250 Wi-Roggen.100 300 Triticale 100 330 100 250 Mais 100200 schlechceTrennung Reis 100 250 Sorghum 100 200Die DNA-Behandluna von Weizenembrvonen in ihrer optimierten Form gestaltete sich wie folgt: 150 mg isolierte Embryonen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur in 500 l eines Inkuba- tionspuffers aus 200 g Plasmid DNA ( = 73 pM) 15 mM NaC1 1,5 mM Trinatriumcitrat 20 % DMSO aufgefulltmit Wasser auf einen Milliliter inkubiert. Auf einem Filter auf festem MS Medium (Murashige und Skoog, Plant Physiol. 15 (1962), 473-497) ohne Hormone mit 100 g Claforanausplattiert, erfolgte die Kultur der Embrvonenbei 24"C,12 Std. Photoperiodeund 600 lux. Nach etwa 3 Tagen Kultur wurden die Embryonen auf Genexpression untersucht.Versuche am Embrvo im SamenNeben isolierten Embryonen wurden auch Embryonen im Weizen-samen mit DNA behandelt. Dazu wurde zunachstder Embryo durch vorsichtiges Abschleifen des Perikarps freigelegt und dann mit 2 bis 3 l des vorstehenden Inkubationspuffers befeuchtet. Sofort oder nach dem Antrocknen wurden die so behandelten Samen zum Studium der transienten Expression entweder auf feuchtem Filterpapier kultiviert oder fur die stabile Transformation auf Erde ausgelegt. Letztere wurden inMultitopfplatte (96 Topfe) bei etwa 24 C im Gewächshaus 4Tage mit einer Folie abgedeckt und anschliepend mit Erde übersiebt. Enzvmtest VerfahrenNPT-Test (Reiss et al., Gene 30 (1984), 211-218;Schreier et al., EMBO J. 4 (1985), 25-32; modifiziert) Der NPT-Test wurde unter Verwendung von 100 pCi t32Pr-ATP1 pro Test und einigen Abwandlungen der Probenaufbereitungen durchgeführt: Die gekeimtenEmbryonen wurden in 2 ml Extraktionspuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 und 5 % ss-Mercapto- athanol) auf Eis in einem Mörser zerkleinert. Das Homogenatwurde anschliepend60 Minuten bei 100000 x g zentrifugiert und NPT II aus dem Überstand bei 50 % (NH4)2S04 gefällt (Zentrifugationen 9000 x g, 15 Min., 4 C). NPT II kann durchAmmoniumsulfat oberhalb30 % ausgefällt werden. Bei einemWert von etwa 45 % ist NPT II nicht mehr im Überstand zu finden. Das Proteinsediment wurde varsichtigmit 250. lExtraktionspuffer gewaschen und dann in 50 l Puffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8; 5 % ss-mercaptoäthanol, 10 % Glycerin und 0,025 % Bromphenolblau) gelast. Die Beispieleerläutern die Erfindung. BeisDiel1Transiente Expression in isolierten WeizenembrvonenErste, nur gelegentlich auftretende NPT II-Signale wurden nach der Inkubation von 15 mg trockenen Weizenembryonen mit 100 pgDNA pro Milliliter in 15 mM NaC1 und 1,5 mM Trinatriumcitrat nach drei Tagen Kultur erhalten. Es galt zu beweisen, dap es sich nicht um ein Artefakt handelte:In einer Versuchsreihe wurden unterschiedliche Mengen (15, 50, 100, 200, 300, 400 mg) an Embryonen in DNA-Lsung(100 g Plasmid-DNA pro Milliliter, 15 mM NaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat) gequollenund anschliessendkultiviert. Doppelproben sollten zeigen, ab welcher Embryomenge regelmapigund reproduzierbar NPT II-Signale auftreten. Zwei Signale wurden bei 200, 300 und 400 mg eingesetzter Embryonen festgestellt. Die Signale bei nur 200 mg waren jedoch noch recht schwach, so dap fürweitere Experimente zunächst300 mg Embryonen eingesetzt wurden. Figurlazeigt das Ergebnis eines Experimentes von DNA-behandelten Embryonen (Dreifachproben: Spur 3-5) im Vergleich zu extrahierten Embryonen ohne DNA-Behandlung (Spur 2). Sodann wurde untersucht, ob trockene Embryonen fur eine DNAAufnahme erforderlich sind. Ein einfaches Experiment sollte den Vorgang der DNA-Aufnahme zeigen. 300 mg Embryonen wurden wie bisher zunachst30 Minuten mit DNA-Lösungbehandelt, dann aber zusatzlich30 Minuten mit der DNA-freien Sung. Mit weiteren 300 mg Embryonen wurde umgekehrt verfahren. Zuerst wurden sie mit Lösungohne DNA und dann mit einer Lö-sung mit DNA inkubiert. Das Ergebnis (Doppelproben) ist inFigur 2 wiedergegeben. Nur trockene Embryonen sind in derLage, DNA aufzunehmen und nach Kultur zu exprimieren. Auperdem erfolgt die DNA-Aufnahme innerhalb der ersten 30 Min. der Quellung. Weitere Experimente haben gezeigt, dapdie DNA-Aufnahme innerhalbder ersten drei Minuten am höchstenist, dann langsam abfällt und nach 15 Minuten weitgehend abgeschlossen ist. Anschliependwurde untersucht, wie sich die Expression steigern lässt. Bisher war unklar, ob die gewählten Anfangsbedingungen optimal waren. Die folgenden Versuche dienten der Klärung dieser Frage sowie einer generellen Verbesserung des Expressionssystems: Zunächst wurde DMSO getestet. Eine deutliche Steigerungder Expression mit zunehmender DMSO Konzentrationbis 20 % wurde festgestellt (Fig. 3). Liegen die DMSO Konzentrationen bei 30 % oder hdher,ist dasFrischgewicht reduziert. Entsprechend sinkt die NPT II Expression. Nach diesem Ergebnis wurde die vorstehend beschriebene DNA-Lösung(100 gPlasmid-DNA pro Milliliter, 15 mMNaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat) wie folgtmodifiziert: 100 g Plasmid-DNA pro Milliliter, 15 mM NaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat, 20 tDMSO. Eine erneute Versuchsreihe mit verschiedenen Embryomengen ergab eine Reproduzierbarkeit der. NPT II-Signale bis 30 mg eingesetzter Embryonen und vergleichbar kraftigeSignale bei 150 und 300 mg (Fig.3, oben). Somit wurde die Embryomengeauf 150 mg reduziert. Mit den beiden geänderten Parametern wurde nun nach der DNAKonzentration gesucht, die maximale NPT II-Expression erlaubt. Der Vergleich von 25, 50, 100 und 200 gPlasmid pro 0,5 ml Inkubationsansatz (150 mg Embryonen, Plasmid-DNA, 15 mM NaCl, 1,5 mM Trinatriumcitrat, 20 % DMSO) zeigte die höchste Expression bei 100 und 200 g DNA pro 0,5 ml (Fig. 3). Damit war unter Verwendung von 100 g Plasmid DNA pro 0,5 ml (bzw. 200 g pro ml) dieser Parameter ins Optimum gerückt.Der optimale Inkubationsansatz bestand daher aus: 150 mg trackenenWeizenembryonen + 100 g Plasmid-DNA (36,5 mM) 15 mM NaCl 1,5 mM Trinatriumcitrat 20 % DMSO aufgefüllt mit Wasser auf 0,5 Milliliter. Inkubiertman Embryonen mit diesem Inkubationspuffer so istNPT IIbereits nach 24 Stunden Kultur zuverlässignachweisbar. Bei einer Kultur von 24, 48 und 72 Stunden zeigt sich eine stetige Zunahme der NPT II-Aktivität. Beispiel 2:Transiente ExPression in Weizenembrvonen am SamenEs wurden Weizensamen verwendet, bei denen der Embryo durchAnschleifen freigelegt worden war. Die Weizensamen wurden mit DNA (gemapden vorstehenden optimiertenBedingungen) behandelt und 3 Tage angekeimt. Die Keimlinge wurden sadannisoliert und auf NPT Ii-Aktivitatuntersucht. Wie auch bei isolierten, behandelten Embryonen wurde NPT II nachgewiesen. Damit war gezeigt, dapauch einseitig behandelte EmbryonenDNA aufnehmen und exprimieren. Beispiel 3:Transiente Expression in GetreideembrvonenMit den fur Sommerweizen-Embryonen etablierten Methadenkonnte eine transiente Expression auch in Embryonen von Winterweizen, Sommergerste, Wintergerste, Roggen, Hafer, Mais,Reis und Triticale nachgewiesen werden.Beispiel 4:Transiente Expression in Lesuminosenembrvonen300 mqGartenerbsen-, Feuerbohnen- und Saubohnenembryonen wurden in Analogie zu Weizenembryonen mit DNA inkubiert. Nach drei Tagen Kultur konnte NPT II-Aktivität nachgewiesen werden. Beispiel 5:Der Weg ins GewächshausKultur von angeschliffenen Samen in Erde 10 Weizensamen wurden wie unter "Material und Methoden" beschrieben angeschliffen und mit 2 l Wasser an derSchliffstelle behandelt.Sie wurden dann auf Einheitserde/Sand (10/1) (im weiteren kurz als ',Erde"bezeichnet) zur Keimung ausgeleqtAls Kontrollewurden unbehandelte S-amenausgelegt. Die Keimung des angeschliffenen Materials erfolgte schneller als die der Kontrollen.Nach 3 Tagen aber zeigten letztere eine bessere Entwicklung. Weitere Beobachtungen ergaben, dassdie angeschliffenen Embryonen teilweiseVerletzungen an Coleoptile,Coleorhiza und darunterliegenden Gµwebenaufwiesen. Auch das Ausbleiben einer Keimung, vermutlich aufgrund von Schadigungen, muptefestgestellt werden. Es wurden jedoch insgesamt 8 Keimlinge mit kraftigem Keimblatt von den angeschliffenen Samen erhalten. Ein Anschlussversuch in Multitopfplatten mit je 96 DNA-behan delten,angeschliffenen Samen und 96 unbehandelten Kontrollen wurde unternommen. Nach drei Wochen Kultur der im Gewächshaus bei 24 C auf Erde und mit Quarzsand abgedecktenSamen, waren 83Kontrollpflanzen gekeimt, von den DNA-behan delten Pflanzen jedoch nur 21. Das bedeutet eine Erfolgs quote von etwa 23 % (Tabelle III). In einem weiteren Experiment wurden je 288 angeschliffene und DNA-behandelte Samen etwa 1-2 cm tief in die Erde ge legt, auf Erde liegend mit Erde ubersiebtbzw. nur auf Erde ausgelegt, vier Tage mit Kunststoffolie abgedeckt und dann ubersiebt.Das Versuchsergebnis nach 3 Wochen geht ebenfalls aus Tabelle III hervor. Die höchste Keimrate wiesen die mit Folie abgedeckten Samen mit 63 % auf. Aufgrund dieses Resul tats wurden in den folgenden Versuchen die angeschliffenen und behandelten Samen auf Erde ausgelegt und wahrendder ersten vier Tage mit einer Folie abgedeckt. Danach wurden sie mit Erde ubersiebt. Tabelle III Elnfluss der Kulturbedingungen auf die Keimrate von angeschlif fenen Weizensamen. Anzahl ausge- Anzahl ge- Keimungsrate varlierter Parameter legter Samen keimter Samen 96 22 23 % Quarzabdeckung 96 80 86 % Koncroile, Quarzabdeckung 28849 17 %1 bis 2 c:nin Erde 288 71 26 % auf Erde, Obersiebt 288 181 53% au Erde.4 Tage Folienab- deckung, dann Übersieben Von11000 ausgelegten, angeschliffenen und DNA-behandelten Samen wurden ca. 4300 Pflanzen bis zur Samenreife herangezo gen. Das geerntete Saatgut wurde unter Selektionsbedingungen, entsprechend dem Marker-Gen (z.B. Kanamycinresistenz durch NPT II) gekeimt, und die uberlebendenPflänzchen wurden sowohlauf das Genproduktdes Marker-Gens, als auch auf das Varhandenseinder zugegebenen DNA untersucht.
    权利要求:
    Claims P a t e n t a n s p r ü c h e
    1. Freigelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen als Aufnahmesystem für fremde genetische Information in Form von DNA oder RNA.
    2. Offengelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen mit einem Gehalt an eingeschleuster fremder genetischer Information in Form von DNA oder RNA.
    3. Embryonen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie isoliert vorliegen.
    4. Embryonen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie freigelegt vorliegen.
    5. Embryonen nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei denen die fremde genetische Information in Form von DNA vorliegt und in das Genom integriert ist.
    6. Embryonen nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei denen die fremde genetische Information in Form von DNA oder RNA vorliegt, die in der Pflanze verbreitet, aber nicht in das Genom integriert ist.
    7. Verfahren zur Herstellung von Embryonen nach Anspruch 1, bei dem man die Samenschale des den Embryo enthaltenden Samens im Bereich des Embryos so entfernt, daß der Embryo für eine fremde genetische Information in Form von DNA oder RNA zugänglich wird, jedoch in seiner Keimfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt wird.
    8. Verfahren zur Herstellung von Embryonen nach einem der Ansprüche 2 bis 6, bei dem man offengelegte reife Embryonen von Nutzpflanzen mit einer wäßrigen Lösung der genetischen Information in Form von DNA oder RNA behandelt.
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wassergehalt der Embryonen höchstens etwa 20 Gewichtsprozent beträgt.
    10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung einen pH-Wert von 3 bis etwa 11 hat.
    11. Verwendung der Embryonen nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zur Regenerierung und Züchtung transgener Nutzpflanzen.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    JPH02503623A|1990-11-01|
    EP0362244A1|1990-04-11|
    EP0362244B1|1994-04-06|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-12-01| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DEP3717301.4||1987-05-22||
    DE3717301||1987-05-22||EP88904525A| EP0362244B1|1987-05-22|1988-05-20|Embryonen von nutzpflanzen als aufnahmesystem für fremde genetische information|
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    AT88904525T| AT103984T|1987-05-22|1988-05-20|Embryonen von nutzpflanzen als aufnahmesystem fuer fremde genetische information.|
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